校准是在线尺子使用中最重要的步骤。屏幕尺寸、分辨率、浏览器缩放都会影响刻度显示，所以同一台设备在不同设置下，测量结果也可能不同。
最常用的校准方法是使用银行卡、身份证或会员卡。这类卡片通常具有较为固定的尺寸，可以作为参考物。将卡片平放在屏幕上，调整校准滑块或输入参考长度，使屏幕刻度与卡片边缘对齐即可。
如果没有卡片，也可以使用硬币、直尺或标准打印纸辅助校准。硬币直径相对固定，适合小范围校准；直尺则可以直接对照屏幕刻度。需要注意的是，不同国家或地区的卡片、硬币尺寸可能略有差异，尽量选择自己确认过尺寸的物品。
校准完成后，可以用一个已知长度的物品进行验证。例如测量一支已知长度的笔，或一张A4纸的短边。若结果偏差较大，应重新校准。更换设备、更换浏览器、调整页面缩放后，也建议重新校准一次。